聚合酶链式反应 (PCR)是分子生物学领域功能强大的技术之一。实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成,常用于定量样本中的 DNA 或RNA。利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料,采用实时荧光定量PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环,实现扩增产物的定量。实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确,从而获得准确的结果。

1、引物和探针的储存

尽管引物和探针的储存经常被忽略,但其在保证实时荧光定量 PCR 分析的长期成功和一致性方面具有重要作用。影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否被长时间暴光、储存的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分。图3扩增曲线分别显示了储存不当的引物 (A) 与储存适当的引物 (B) 产生的效果。

2、长期保持引物和探针的稳定性保持引物和探针的稳定性的关键有四点：

（1）低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。引物一旦重新溶解,即应置于 -20°C 保存,且若保存时间超过一年则应对其进行监测,看它是否出现功能下降。

（2）对于标记的引物和探针,则应采取措施避免标记物暴光 (例如使用不透明管及置于暗处保存),以延长它们的使用寿命。

（3）引物浓度也可影响其稳定性。建议引物的储存浓度不低于10 μM；实际上,在大多数情况下,100 μM 的引物浓度操作更简单。引物和探针还应分装保存,以减少冻融次数,特别是标记的引物和探针。

（4）最后,TE 缓冲液可形成比水更为稳定的环境。此外,含有 0.1 mM EDTA的 TE 缓冲液 (标准 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一种理想的溶液,这是由于一些 PCR 反应对 EDTA 的灵敏度可能有一些残存。