免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。以荧光抗体方法较常用。 用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。

免疫细胞荧光实验流程：

1、细胞爬片制备

1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中

2）、细胞生长达到60％后取出盖玻片

3）、用PBS清洗盖玻片3次

4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖

上盖子以防止蒸发）

5）、用PBS清洗盖玻片3次

6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）

7）、干燥8-10小时,放入-20°C保存

8）、实验前解冻爬片,在室温下用中性PBS浸泡10-15分钟

注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。在这种情况下,可以尝试红色或红外的荧光素。

2、破膜

1）、0.1％Triton孵育10min

2）、PBS洗涤3次,每次3分钟

3、抗原修复

1）、用滤纸擦干细胞爬片

2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液

3）、在室温下孵育10分钟

4）、用PBS洗涤3次,每次10分钟

4、封闭

1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）

2）、37°C孵育30分钟

3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）

5、一抗孵育

1）、用抗体稀释液稀释一抗,达到抗体制造商推荐的浓度

2）、将稀释的抗体（推荐浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上,4°C孵育过夜

3）、用PBS洗涤3次,每次15分钟

6、二抗孵育

1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗

2）、将稀释的抗体加到爬片上,37°C孵育30分钟

3)、用PBS洗涤3次,每次8分钟

7、染色

1)、爬片上滴加稀释好的SABC-FITC或SABC-Cy3试剂

2）、37°C孵育30分钟（避光）

3）、用PBS洗涤2次

4）、滴加DAPI染液,避光孵育10min

5）、用PBS洗涤3次

6）、用抗荧光衰减封片剂封片,荧光显微镜下观察结果。

实验流程图如下：