众所周知,Vero细胞是一种贴壁依赖性细胞,被广泛应用于病毒疫苗的生产平台。在台式生物反应器中,Vero细胞通常生长于球状微载体表面。LeProlif®Sphere 球状微载体是一种用于高产量培养贴壁细胞的球状微载体,为动物细胞的生长提供了适宜的表面,可用于悬浮培养系统中。
为了进一步满足客户的应用需求,我们对微载体的粒径进行了优化,使粒径范围更加均匀。本次我们在10L的LePhinix®️EZG台式罐反应器中进行了 Vero 细胞的培养,我们成功开发出Vero细胞"躺平"新姿势,进一步证实了用 LeProlif® Sphere球状微载体培养 Vero 细胞生产疫苗的巨大潜力。
实验描述
在10L的LePhinix® EZG台式罐生物反应器中进行了Vero细胞的培养,培养体积为5L,载体浓度为4 g/L,细胞接种密度为2.0×105 cells/mL。
在培养至第4天时达到平台期,细胞密度达到了3.6×106 cells/mL左右。
第3天更换为2% FBS的低血清培养基,细胞密度和活率可在低血清培养条件下维持5天,整个培养过程中的细胞活率维持在90%以上。
设备与耗材
在10L的LePhinix® EZG台式罐生物反应器中,我们对Vero细胞在粒径优化以及提高浓度后的LeProlif® Sphere球状微载体上的生长进行了测试。
中间通过更换培养基维持细胞培养状态,在细胞处于对数生长中后期时更换为低血清浓度的培养基,模拟接毒的条件,以掌握Vero细胞在该工艺下的增殖特性,为Vero细胞在病毒制备中的应用提供了相应的参考。
LeProlif®️ Sphere 球状微载体
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以交联葡聚糖为基底,表⾯修饰正电荷
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贴壁面积积约为 4400 cm2/g
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特殊的材料表⾯改性⼯艺提高细胞贴壁率及均匀度,⽀持⾼密度灌流培养
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可在台式罐生物反应器/⼀次性生物反应器内进⾏悬浮培养,方便放⼤
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可将细胞从微球表⾯消化下来进⾏收获
LePhinix®️ EZG台式罐生物反应器
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球状微载体湿热灭菌后通过接管机无菌焊接后接⼊反应器内
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可搭配不锈钢筛⽹进行灌流培养,将微载体截留在罐内进行换液操作或者收获细胞
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工作体积：1L—10L
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以该实验为例,5L 的培养体积,载体浓度为 4 g/L,提供的细胞贴壁⾯积达到了88000 cm2
表1 各种细胞培养容器的生长表面积比较
实验步骤
接种
种子细胞在 T培养瓶 和细胞⼯⼚⾥培养制备,最终接进 10L LePhinix®️ EZG台式罐生物反应器中。
Vero 细胞扩增工艺示意图
细胞培养参数设置
Vero细胞在台式罐生物反应器内进⾏培养,通过LePhinix®️ EZG台式罐生物反应器的控制器进行控制。
表2 工艺参数和设定值
测试结果
4 g/L 的载体浓度,2.0×105Cells/mL 的细胞接种密度,培养体积为 5L,培养8天,Day 0-Day 4 为细胞扩增阶段,Day 2 换液1个VVD,Day 3 更换为无⾎清培养基,因没有⽤无⾎清培养基清洗微载体,彻底置换原培养基,因此更换⽆⾎清培养基后整个培养体系的⾎清浓度为 2% 左右,Day 4 到达平台期,平台期的细胞密度约为 3.6×106 cells/mL,该细胞密度维持至 Day8,整个培养过程中细胞活率维持在 90% 以上,细胞密度和活率的结果⻅图4,细胞贴壁效果见图5。
Vero 细胞培养活细胞密度和活率
Vero 细胞在球状微载体上不同时期的贴壁状态
测试结论
4g/L的载体浓度下,Vero 细胞在罐内培养⾄第 4 天达到了3.6×106 cells/mL左右的细胞密度,并可以在 2% 低⾎清浓度下维持 5 天,显示了 Vero 细胞在病毒制备中的巨大潜力,为接种病毒时期提供了重要的参考数据。
LePhinix®️ EZG台式罐生物反应器可以很好地支持 LeProlif® Sphere 球状微载体的 Vero 细胞培养,搭配不锈钢筛⽹实现灌流培养,可根据客户不同载体浓度的需求改变搅拌桨叶的尺⼨和数量,为客户实现定制化服务,并实现精准控制。
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