His标签由于其分子量小、与金属离子结合能力强以及在变性条件下也可保持与介质结合的特性,已成为常用的亲和标签。固定化金属离子亲和层析(IMAC)原理为：暴露在蛋白质表面的某些氨基酸侧链(主要是His,及少量的Cys和Trp),可与过渡金属离子之间发生特定的可逆性相互作用,从而实现对蛋白的分离纯化。金属离子通常为Zn2+、Ni2+、Cu2+或Co2+,如今用Ni2+固定化金属离子亲和层析已成为纯化组氨酸标签蛋白的标准方法。蛋白质/肽与固定化金属离子相互作用的强度取决于氨基酸侧链的类型、数量和空间分布,以及所使用的金属离子的性质。
常见的Ni螯合方式：
Ni填料在兽用亚单位疫苗的应用
基因工程亚单位疫苗,在表达载体序列中加入His-tag标签以达到快速层析纯化获得目标蛋白,发酵培养后通过金属螯合亲和层析填料Ni Chromstar FF或Ni Chromstar Excel一步层析纯化即可获得较高纯度的目标蛋白,经Puredex G-25 M或UF/DF进行缓冲液置换即可进行制剂配苗。
典型案例：百林科Ni填料在重组亚单位疫苗的应用：
某兽用亚单位疫苗案例
由图可知,发酵后菌体破碎澄清后经一步Ni填料亲和层析纯化后,目标蛋白纯度高,后续经浓缩与换液后即可进行后续制剂配苗。
典型案例：百林科Ni填料在重组胶原蛋白的应用：
大肠表达的重组胶原蛋白应用案例
由图可知,重组胶原蛋白经一步Ni Chromstar FF纯化后可得较高纯度蛋白洗脱液,后续经Puredex G-25 M脱盐换液后再进行离子交换层析精纯可得高纯度重组胶原蛋白。
不同Ni螯合方式纯化效果对比(另一重组胶原蛋白)
1、Ni Chromstar FF与Ni Chromstar Excel均可用于纯化重组胶原蛋白；
2、Ni Chromstar Excel洗脱纯度明显较Ni Chromstar FF高,对于杂质的去除有显著的改善效应。
鉴于以上情况,Ni亲和填料在各种重组蛋白项目上应用较多,而实验中也会经常遇到各种问题,该如何解决呐？以下汇总了常见问题以及对应解决方法：
01 His标签蛋白与亲和介质不结合
① His标签未翻译表达
解决思路：
Ø 使用Western blot方法检测His标签是否表达
Ø 重新构建目的蛋白分子,改变插入His标签的位置(C端或N端)
② His标签暴露不充分
解决思路：
Ø 向样品中加入一定量变性剂(如：3～8 M尿素,3～6 M盐酸胍等),再上样纯化
Ø 重新构建目的蛋白分子,适当增加组氨酸基团个数,或在His标签与目的蛋白之间加入一段Linker
02 His标签蛋白纯化后纯度低
① 介质的离子交换作用,导致了非特异结合
解决思路：
Ø 在平衡液、样品、洗脱液中,加入0.5 M NaCl,屏蔽介质的离子交换作用
② 杂蛋白也能与金属离子结合
解决思路：
Ø 调整样品与介质的结合条件,比如预先在样品及平衡液中加入10～50 mM咪唑,屏蔽与介质弱结合的蛋白
Ø 洗脱过程采用梯度洗脱方法,摸索最佳纯度条件
Ø 尝试其他金属离子螯合亲和层析介质
Ø 在目的蛋白分子上额外构建一个蛋白标签,如：GST标签,两步纯化目的蛋白,或衔接其他纯化方法进一步纯化
③ His标签蛋白被降解
解决思路：
Ø 细胞破碎过程中释放的蛋白酶可能会降解目的蛋白,导致带有His标签的小片段产生,形成产品相关杂质,可以在处理样品过程中加入一定量蛋白酶抑制剂
Ø 如果目的蛋白自身不稳定,会发生降解,则需要摸索维持目的蛋白稳定的最佳条件,包括温度、缓冲液成分和操作时间等
03 His标签蛋白无法洗脱
① 目的蛋白与介质结合能力过强
解决思路：
Ø 进一步增加洗脱咪唑浓度,或同时适当降低pH值
Ø 通过脱落金属离子,进行洗脱,可用pH值3.5条件或EDTA进行洗脱
② 目的蛋白沉淀在层析柱内
解决思路：
Ø 摸索维持目的蛋白稳定的最佳条件,包括温度、缓冲液成分和操作时间等
Ø 适当降低上样量
Ø 用变性剂洗脱,如8 M尿素或6 M盐酸胍
04 层析介质变色
① 介质长期使用,出现白色
解决思路：
Ø 如果介质长期使用,或单次使用上样量较大时,会导致介质金属离子脱落,从而导致介质变白,可通过介质再生解决
Ø 如果介质表面结合了大量目的蛋白,在纯化过程中,会略显白色,洗脱后颜色会恢复,属于正常现象
② 介质在纯化过程中,出现棕色
解决思路：
Ø 介质在纯化过程中变成棕色,主要是受缓冲液或样品中还原剂的影响,可以选择去掉还原剂成分,或者使用Ni Chromstar Excel介质
③ 介质长期使用过程中,出现黄色
Ø 介质在使用过程中,会积累非特异性吸附的杂质,包括蛋白、色素等。同时在层析柱顶端也会积累沉淀蛋白,长期使用后,就会出现介质顶端发黄的现象。此时,往往伴随着介质载量降低、柱效降低、柱压变大等情况。可通过在位清洗方法,系统的对层析柱进行清洗,解决这一问题,并建立合理的介质寿命维护方法
百林科层析填料家族
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