其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料,DNA扩增的过程中,荧光染料特异性地掺入DNA双链,发射荧光信号,随着反应的进行,荧光强度逐渐增强,并且可以实时测量。如果你要扩增你的目标样品40个循环,在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。

优点：

1、成本较低,适合大规模的实验。

2、在实验设计阶段非常省时,因为它只需要合适的引物设计。

缺点：

1、特异性不是很高。染料可以插入任何双链DNA,包括引物二聚物和非特异性产物。

2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染,得到的结果会不可靠。3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。

需要更多的时间进行结果分析。

这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子),探针通常在5 '端和3 '端都被标记。

在探针的5'端有报告基团,3'端设计淬灭基团,当报告基团接近淬灭基团时,不会检测到荧光信号。RT-qPCR反应时,寡核苷酸两个基团分离,即可检测到荧光信号,并与PCR产物同步。

使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游

互补序列的结合。

优点：

1、更有可能只放大所需的产物,由于引物和探针的结合具有特异性。

2、不需要解离曲线,只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。

3、由于具有特异性,数据更可靠。

4、数据分析时节省时间。

缺点：

1、需要大规模实验时耗费成本高。

2、需要更长的时间来设计实验,因为需要好的引物和探针。