研发和生产中,提到内毒素,脑袋里冒出的第一个想法是不是 "难缠的对手"？那么,如何给予"对手"强有效的致命一击呢？别急,咱们接着聊。
内毒素(Endotoxin)是复杂的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),构成所有革兰氏阴性菌外细胞壁的固有部分,并负责细胞壁的组织和稳定性。它们由三个不同的区域组成：菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A。其中,脂质A是其主要的毒性成分。
在细菌细胞死亡溶解或用人工手段破坏了细菌细胞结构后,内毒素会被释放出来,对宿主造成毒性作用。对于内毒素引起的毒性反应,主要有发热反应、多器官功能衰竭、感染性休克、败血症、脑膜炎球菌血症等。
内毒素单体分子量约10KD左右,在不同成分的水溶液中,可形成大分子聚合体,最大可以超过1000 KD。内毒素对热有很强耐受性,只有160℃以上的高温持续2~4 h,或者采用强酸、强碱、强氧化剂加热煮沸30 min以上才能破坏其生物活性。
由于内毒素的危害性,中国药典和美国药典对于内毒素的检查和要求都做了明确规定：在研发和生产过程中,除了确保无菌操作及所有与料液有接触的设备、耗材、试剂等均无引入外源性内毒素污染风险的同时,采取必要且有效的工艺手段或工艺方法,降低或去除内源性内毒素污染,达到工艺要求,提高产品安全性。
去除内毒素有多种工艺方法,层析技术目前也是从成本和有效性上比较突出的方法之一。利用内毒素分子的不同性质,可以采用不同原理的层析方法,其中,本文重点展示了层析方法中的离子交换层析法。
内毒素含有脂质A,而脂质A中含有多个磷酸根结构,等电点比较低,通常是3.1。当溶液pH值高于其等电点时,内毒素带有部分的负电荷,可以结合带正电的阴离子交换层析介质。因此,可以利用强阴离子交换层析介质结合内毒素,目标蛋白流穿的方式去除内毒素。
其中,百林科可以提供不同的强阴离子交换层析介质的选择,如MaXtar Q、MaXtar Q HR、MaXtar Q HR XL、Q Chromstar BB、Q Chromstar FF、Q Chromstar HP、Q Chromstar XL、Q Chromstar BB XL等,根据不同的工艺要求,可以选择不同的层析介质。
MaXtar Q HR参数介绍
* 动态载量的测量条件：
装柱高度：10 cm,测试流速150 cm/h ,测试缓冲液：0.05 M 乙酸钠溶液,pH4.75,测试样品：6 mg/ml 的BSA 样品,当BSA 的穿透量达到10% 时,单位介质体积(ml) 的BSA 上样量(mg)。
** 工作范围:
在该pH值范围内,介质的功能不发生明显变化。
*** v/v：体积比
应用案例：
质粒纯化中使用MaXtar Q HR去除内毒素
✦ 层析柱：Chrom-Screen MaXtar Q HR 4.7ml；10 cm
✦ 上样：亲和纯化后质粒样品(保留时间：5 min)
✦ 平衡液：0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
✦ 洗脱液：1.0M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
MaXtar Q HR层析图谱
小结：经MaXtar Q HR填料纯化后,内毒素含量<5EU/mg,符合内毒素控制的质量要求。
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参考文献
1.Kim, S.E., Su, W., Cho, M., Lee, Y., Choe, W.S., 2012.Anal Biochem.424, 1, 12-20.
2.Su, W., Lin, M., Lee, H., Cho, M., Choe, W., Lee, Y., 2012.Biosensors and Bioelectronics.32, 32-36.
3.Ding, S., Chang, B., Wu, C., Chen, C., Chang, H., 2007.Electrochem.Commun.9, 5, 1206–1211.
4.Gutsmann, T., Howe, J., Zahringer, U., Garidel, P., Schromm, A.B., Koch, M.H., Fujimoto, Y., Fukase, K., Moriyon, I., Martinez-de-Tejada, G., Brandenburg, K., 2010.Innate Immun.16, 39–47.
5.国家药典委员会.中华人民共和国药典：三部[M].北京：中国医药科技出版社,2020：42-48.
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