羟基磷灰石是一种无机纯相层析介质,高温焙烧成球体,其球体结构稳定,粒径较为均匀。羟基磷灰石与生物分子之间具有多种模式的相互作用,可同时实现阳离子交换和钙金属亲和两种分离机制。阳离子交换主要依赖于羟基磷灰石上带负电荷的磷酸基,同时,生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通过金属亲和作用与羟基磷灰石上的钙形成更强的结合。由于这些分离机制,使得羟基磷灰石成为当今要求很高的下游工艺中重要的层析介质,在抗体、疫苗(细菌多糖、肺炎多糖、病毒等)、核酸、酶和重组蛋白等生物制药领域中发挥重要作用。可以用于宿主蛋白(HCP)、脱落的ProteinA、抗体二聚体及聚合体、核酸及病毒的分离,经常用于捕获、粗纯或精纯各个纯化阶段。
百林科目前共有两款羟基磷灰石层析介质：BaronCHT type I和BaronCHT type II,两种型号主要由不同烧灼温度及时间生成,Ⅰ型为400℃、Ⅱ型为 700℃。目前上市的两款CHT主要粒径为40um。
图1：百林科羟基磷灰石电镜图
CHT I型的蛋白载量比较高,适用于纯化单、双抗、重组蛋白等项目,且对酸性蛋白具有更高的载量。CHT II型载量较I型载量低,对核酸及某些蛋白具有更好的分辨率,适用于纯化质粒、mRNA等类型项目。CHT II型对白蛋白有低的亲和力,更适合纯化各类免疫球蛋白及其亚型。
羟基磷灰石因含有钙和磷酸根存在,可稳定的使用pH6.5-14溶液中,兼容以下试剂:
目前使用羟基磷灰石最主要的痛点有两个：一是寿命,通常CHT寿命一般在40个Cycle左右,但是与具体的使用条件息息相关；二是该如何做工艺的优化。
►►►影响CHT的寿命的常见因素
➣ 杂质较多较粘稠的料液会严重影响填料寿命。
➣ 使用过程中PH环境长期暴露在 pH 6.5及以下酸性条件下降会造成CHT 的损坏导致减少 CHT 的使用次数。
➣ 羟基磷灰石使用时的所有缓冲液中均不能含柠檬酸或EDTA,这些整合剂会降解羟基磷灰石降低其使用寿命。
►►►提升CHT寿命的技巧
➣ 溶液中添加磷酸根或是钙离子也可提升羟基磷灰石的结构稳定维持其使用寿命及性能(钙离子Ca2+会与磷酸根产生沉淀反应,添加量不宜超过2mM)。
➣ 在实验时,洗脱前增加一个弱碱洗脱步骤能够大幅提高柱子寿命,比如使用表面中和体系溶液(surface neutralization system,SNS)25mM Tris-HCl,25mM NaCl,5mM phosphate pH7.75运行 6-8CV。这种SNS溶液可以有效减少洗脱过程中的PH漂移程度和使用过程中层析柱反压的升高,能有效地减少羟基磷灰石钙离子的流失,以助于提升填料的寿命。
➣ 同时加入Arginie,lysine,histidine,PIPES,HEPES,MES,MOPS,的添加也能大幅度减低 CHT 中质子释放,使PH下降的幅度大大减少,减少了 CHT暴漏在低pH环境的时间而提高CHT 的使用次数。
图2：在溶液中添加MES对于pH 漂移的影响
羟基磷灰石
使用原理及优化策略
羟基磷灰石包括两个结合位点：Ca和 PO4,这些结合位点按照其自有的晶体结构分布。 PO4离子与带正电的蛋白质以离子键结合,具有阳离子交换特性；其中的Ca离子与带负电蛋白质的自由羧基簇以金属鳌合方式结合。
不同的结合模式下的使用策略：
✦阳离子交换作用：当蛋白带正电荷时候,可以与 PO4结合,而与Ca是相互排斥,这种作用主要是阳离子交换作用。这种阳离子交换作用会受到洗脱缓冲液中的中性盐浓度 (如NaCl) 或者平衡液中磷酸盐浓度的影响。这种作用随着 pH 的增高也会相应减弱。因此,增加盐、磷酸盐的浓度或增高 pH,都会减弱目的蛋白与PO4之间的相互作用。
✦钙金属鳌合作用：Ca可以与蛋白或其他分子(如核酸)表面的羧基簇或磷酸基团发生金属整合作用,而同时与 PO4相排斥。这种结合方式作用力是一般离子交换的 15-60 倍。所以这种结合方式受离子的影响比较小,对 NaCl不敏感。而且这种作用力随着离子强度会增加钙金属整合力,原因是由于离子强度的增加屏蔽了分子表面功能基团与 PO4之间的相互排斥作用。这种结合方式可以通过磷酸钠进行洗脱。
图3：羟基磷灰石作用原理图
因此,基于上述两种作用机理,羟基磷灰石使用的常规缓冲溶液选择一般为第一种：平衡液10mM PB PH6.8、洗脱液400mM PB PH6.8；第二种：平衡液10mM PB PH6.8、洗脱液10mM PB+1M NaCl PH6.8。
如果遇到结合弱,容易流穿,以及洗脱难度大,可以采用以下办法：
1.对于结合力较弱的样品可以降低平衡液中磷酸盐浓度提高结合能力。
2.对于洗脱难度较大的样品可以使用高浓度的磷酸钾溶液进行洗脱。
羟基磷灰石的常见再生方法：
a.对于羟基磷灰石的再生一般使用500mM 中性磷酸盐或磷酸钾溶液或400mM 磷酸钠清洗 3-5CV完成再生。
b.也可以用包含 5mM 磷酸根的中性KCl,NaCl,6M 尿素或 8M 盐酸胍清洗柱子。
c.由于羟基磷灰石自身性质具备很高的耐碱性,因此对其清洁消毒最高可以使用到2M NaOH(常规0.5M即可),其保存溶液也可以直接选择0.1~1M NaOH。如果要使用低于0.1M NaOH进行保存,则需向保存液中添加10mM浓度的磷酸盐。
羟基磷灰石的装柱技巧：
1)装柱时,由于羟基磷灰石自身材质的问题,不具有压缩性。
2)要使用流速装柱而不要使用重力沉降装柱。
3)在装柱过程中,剪切力很容易破坏颗粒,为了避免破坏,装柱时候要选择30%~50%的匀浆比,使用最小的力量轻轻的混合。
4)对于40um CHT,一般使用10um 的筛板
5)最终下沉柱头时不要接触到填料,当柱子装好后,要保持柱床稳定。可参考百林科Baron CHT填料说明书中的装柱步骤方法可获得更好的装柱帮助。
基于CHT的特殊的作用原理,通常它会带来常规介质不能达到的效果,也经常被用于双抗的纯化,重组蛋白的纯化以及一些多糖疫苗和重组因子类等产品的纯化。
CASE 1
CHT 用于双抗中进一步提升纯度
双抗项目,用于去除聚集体实现更高的纯度,SEC纯度由95%提升至99%,回收率86%。
● 层析柱：4.7mL Baron CHTⅠ型预装柱
● 上样量：36.9mg/ml；线性流速120cm/h
● 平衡液：5mM PB PH6.8；
● 洗脱液：5mM PB+1M NaCl PH6.8
图4：层析图谱
图5：HPLC 检测图
CASE 2
CHT 用于重组类因子的纯化
CHT 用于重组类因子的纯化,纯度可达94%。某重组因子项目,与进口友商进行性能对比。
● 产品：BaronCHT Type I,40μm
图6：百林科CHT I型与进口友商性能对比
通过分析,收率、纯度及质量与进口友商处于同一水平。
表1：百林科与进口友商数据对比
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