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【AAV热点应用】Zetasizer精准表征rAAV颗粒粒径及衣壳滴度
阅读：187 发布时间：2022/6/9
腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。其直径约为20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA。重组腺相关病毒载体（recombination AAV, rAAV）则是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的,因其具有：安全性高、免疫原性低；宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）；体内表达时间长；血清型众多,且具有组织特异性等特点被广泛用于基因治疗、疫苗等研究、应用领域[1]。
在rAAV的生产工艺中,有无团聚体（aggregate）,以及衣壳滴度（titer）的高低是重点考察的关键质量属性（CQAs）[2],Zetasizer纳米粒度仪通过对rAAV颗粒的粒径及衣壳滴度的表征,快速实现该CQAs的鉴定。
纳米粒度电位仪
马尔文帕纳科 Zetasizer Ultra
01
将两种不同生产批次的rAAV分别用缓冲液稀释至合适的浓度,利用Zetasizer Ultra-Red （Malvern Panalytical Ltd.）以及小体积石英比色皿（ZEN2112）进行相应的粒径和滴度测定[3]。样品测试体积为20 µL,rAAV折射率、吸收率分别设置为1.45和0.001,缓冲液的散射光强度测定为80 kcps。
02
通过多角度动态光散射（multi-angle DLS, MADLS）技术,我们分别对两种批次的rAAV粒度大小及分布进行表征（图1、3）。可以看到,批次1的rAAV只有一个粒径分布峰,其值大小为28.2 nm,说明体系中没有团聚体产生,而批次2的rAAV则呈现出3个粒径分布峰,分别位于28.2、150.9以及430.6 nm,这说明体系中除了rAAV单体,还有团聚体产生。
此外,基于MADLS技术得到的颗粒的准确粒径分布图,我们还能得到对应尺寸的衣壳滴度（图2、4）。
图1,批次1 rAA的光强粒径分布图
图2,批次1的衣壳滴度
图3,批次2 rAA的光强粒径分布图
图4,批次2的衣壳滴度
参考文献
1.Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al.Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs.Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.
2.Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al.Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies.Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.
3.Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al.Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques.Pharmaceutics, 2021, 13, 586.