HiFi One-Step RT-PCR Mix(电泳)返回列表页

商品属性：

产品介绍：

末端转移酶（TdT）是一种不依赖于模板的 DNA 聚 合酶,催化脱氧核苷酸结合到 DNA 分子的 3'羟基端。带有 突出、凹陷或平滑末端的单双链 DNA 分子均可作为 TdT 的 底物,加尾长度可达 5~300nt。本酶经电子重构架技术筛选, 使其可以在 45°C 高温下反应,从而避免因 DNA 二级结构造 成的加尾效率下降。 该酶广泛用于 DNA 的 3'末端添加同聚物、利用修饰碱 基（如 ddNTP,DIGdUTP）标记 DNA 3'末端、TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）等试验。

活性定义：37 ℃ 60 分钟内,催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3'羟基末端中所需的酶量定义为 1 个活性单位
热失活：75°C 20min。
储存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事项
1、适量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性丧失。
2、金属离子螯合剂,较高浓度的铵根离子、氯离子、碘例子和磷酸根离子均对 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 数的计算,长度为 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本试剂采用稳定高效的 RT-PCR 预混体系,是以 RNA 为模板进行一步法 RT-PCR 的专用试剂。其原理为用基因特 异性引物进行反转录反应,获得第一链 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一链 cDNA）,再使 用基因特异性正向引物和反向引物进行 PCR 扩增,在同一 反应体系中一步完成从反转录到 PCR 的全部过程。反应体 系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色）,反应后可以 直接进行电泳。 在本试剂盒中,将耐热 M-MLV 反转录酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及稳定剂等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 预混液；反应 Buffer、dNTP 以及 电泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此 使得操作更加简单便,扩增产物可用于平端克隆和 DNA 测 序。
主要优势：
 耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构,只需 10min 即可完成逆转录。
 DNA 聚合酶为热启动型高保真酶,能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性,酶激活仅需 2min。
 具有宽泛的模板量兼容性,10 ng~1μg 都可有效扩增。
 反应过程中无需开盖,避免了操作过程中的污染危害。
组分
名称 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
储存：请置于-20°C,可保存 2 年；避免反复冻融。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高,第一次使用之前要离心收集至反应管底部,吸取时应缓慢小心。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶,反应配制可在常温进行,但各组分应-20°C 保存。
实验操作和反应条件：
1.按以下组分配制反应液
RNA（病毒 DNA/RNA 样品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特异性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特异性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超过 1 μg 的 RNA 模板量会抑制 PCR 反应,建议第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板,然后根据结果进行优化。
2.在 PCR 仪上按以下条件进行 RT-PCR 反应:
55°C, 10min 逆转录反应
95°C, 2min 失活 M-MLV,并激活高保真聚合酶
95°C, 20s 30~40 cycles
TM°C, 20s
72°C ,
2Kb/min
72°C, 2min 末端延伸
3.PCR 反应结束后,可取 5 μl 产物直接进行电泳检测。预混液中已经包含绿色染料,无需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 电泳时,蓝色指示剂指示 3~5 kb,黄色指示剂指示<50 bp。

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