ELISA实验操作质控全方面探讨

    在ELISA的研发制备中尤为重要的就是它的指控流程，包括抗原设计及制备筛选，抗体制备，标准品的定量，检测液的优化，试剂盒的组装，以及各种性能的验证。对于科研工作者来说，要制备一个好的ELISA kit，需要具备敏感性高，特异性强，重复性好，并且其试剂稳定、易保存，操作简便等。下面来看一下ELISA的质控控制。

1. 抗原抗体选择
ELISA检测原理基于抗原抗体反应，其质量影响了试剂盒的性能。对于大分子蛋白抗原，多采用双抗体夹心法，使用优的抗体对，且至少有一种为单抗，配对筛选最佳信噪比的包被和检测抗体。对于抗原为多肽和小分子（或者偶联物），多采用竞争抑制法，抗体的是经过验证的单克隆抗体或者多克隆抗体。
2. 标准品
对于标准品定量的准确性，每个公司对于定量标准和方法可能会有不同，这是企业标准。试剂盒使用的标准品多为重组蛋白或者单价的小分子， 定量可参考国际标准品，国家标准物质信息网或者一些大公司，如R&D， Abcam等。标准品的定量直接会决定试剂盒最后样本的检测结果。
3. 天然样本验证分析
我们在选择样本时，避免使用有外源性污染的样本，避免血样本出现溶血、细菌污染，最好使用较新鲜样本，避免反复冻融。
血清是最为常见的检测样本，但是大约40%的血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子RF、补体、交叉反应物质和异嗜性抗体等其他物质等。避免其发生的方法有：
①标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。
②用2-C2H6OS加入到标本稀释液中使RF降解。
③56℃ 30 min加热血清使补体灭活。
在样本检测中，稀释对于实验的成功也至关重要，稀释过度以及稀释不足均有可能导致样本的测值低。Elisa 实验较为常见的一个现象就是钩状效应，即抗原与抗体比例不合适而导致假阴性的现象，抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含量很高，而没有进行正确的稀释，就有可能会导致假阴性反应。
4. 阳性及阴性对照
用于评判试剂盒以及当次检测结果的客观性和可信性。阴性对照一般选择blank或者一定不含有受检物质的样本；而阳性对照是经检验呈现阳性结果的样本，其含量可用于评判当次ELISA检测结果的准确性和客观性。
5. 特异性
包括交叉反应和干扰效应，在研发过程中需消除样本非特异性引起的假阴性和假阳性。在ELISA试剂盒中最为关键抗体一定是经过反复检测的，保证不与相关的类似物反应。
6. 灵敏度
此标准可评估试剂盒质量优良的一个关键因素，这是由使用的抗体效价等决定的，在研发过程中，一般会优化保证高灵敏度、低背景的检测结果从而大大提供试剂盒的灵敏度。
7. 精密度
即为同一样本重复测定的符合程度，可分为批内精密度和批间精密度。一般是选取同一批次或者不同批次的试剂盒对不同浓度的样本进行定量检测，需要尽量降低批次差异带来的系统误差，保证相同样本结果的重复性。一般在研发过程中使用多个样本检测不同批次进行对比，保证试剂盒通过稳定性和重复性的检测。一般厂家的kit需要保证批内批间CV%<20%。
8. 线性
样本经梯度稀释后检测分析即为线性分析，此过程也是用于消除样本的基质效应。基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来，当存在基质效应时样本的稀释线性就不会满足，说明该类样本有可能不适用ELISA kit，在研发阶段就需要优化反应体系等消除基质效应带来的干扰。
9. 回收率
回收实验可检测试剂盒是否受干扰因子的影响，也是辨别基质效应的一种方法。在研发过程中，一般会采用低、中和高浓度的分析物被掺入到已知浓度的验证样本中，进行回收实验测定，回收率应介于80%-120%，表明试剂盒的性能较好。
10. 稳定性
即试剂盒在有效期内的稳定性。通常采用加速降解的方法来推断试剂盒的有效期。通常试剂盒在37℃放置一天折合有效期2个月，实际工作中，一般将试剂盒在37℃破坏3-7天后，然后检测上述指标，观察是否在范围内。也可留样至有效期后进行检验，来衡量有效期，对于批量大的指标，可将加速降解和留样检验相结合的方法。
另外，ELISA实验操作时质控标准如下：
1、严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。
2、加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻di。
3、封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。
4、用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。
5、合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。
6、加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
7、显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。
8、加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
9、应保证C清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。