细胞培养中细胞不贴壁全面分析

      大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长，在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。贴壁的过程：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面）。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。

       一些特殊的促细胞附着物质（如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质，存在于培养液尤其是血清中。在培养过程中，这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上，悬浮的圆形细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着，以后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否和细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。

       细胞贴壁细胞（除肿瘤细胞外）在体外培养条件下，完成贴壁后均为单层生长，原因是贴壁细胞有接触性抑制的特点。一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。由于贴壁细胞的一面是紧贴在培养瓶上的，如果其上方存在细胞与其相粘附，那么下方的细胞很快就会缺乏营养饿死。

不贴壁的一些原因：

1. 胰酶消化时间把控不当：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。

2. 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。

3. 支原体或细菌的污染。

4. 培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。

5. 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。

6. 接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。

7. 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。

如何促进细胞贴壁：

1. 适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。

2. 最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。

3. 正确配制消化液或培养液。

4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。

5. 复苏新的细胞，第一周用20%血清帮助细胞复原。

6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。

7. 细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。

8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。