提高RT-PCR反应体系的灵敏度方式解读

     RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)，也称为逆转录PCR，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。提高RT-PCR反应体系的灵敏度几个方法：
1、分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA应保-证全长并且不含逆转录酶的抑制剂如EDTA或SDS等，以及尽可能减少基因组DNA污染。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的大值。

2、使用无RNaseH活性的逆转录酶
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。

3、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二结构，从而使引物可以结合。

4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到*链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二结构，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。

5、RNaseH处理
在PCR之使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，在cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。

6、小量RNA检测方法的提高
当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。对于小于50mg的组织106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。

7、减少基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中有基因组DNA污染，可以在逆转录之使用扩增的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的DNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于污染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。