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PCR反应扩增产物平端连接法实验详述

时间:2024/8/12阅读:483
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实验原理:

       平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。
       如果要求不高,PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,这两种酶有5’→3’校对能力,扩增出来的PCR产物已经是平头,可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。
        通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
        这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高,在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。
        对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物。


实验步骤:

一、PCR反应
1.  依次混匀下列试剂
(1)H2O:35 μl
(2)10×PCR反应缓冲液:5 μl
(3)25 mmol/L MgCl2:4 μl
(4) 4种dNTP:4 μl
(5)上游引物(引物1):0.5 μl
(6)下游引物(引物2):0.5 μl
(7)模板DNA(约1 ng):0.5 μl
(8)混匀后离心5秒。
2.  将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5 μl约2.5 U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3.  用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
1.  酚/ lv仿法
(1)取反应产物加100 μl TE。
(2)加等体积lv仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
(3)再用酚:lv仿:抽提二次,每次回收上层水相。
(4)在水相中加300 μl 95%乙醇,置-20℃下30 min沉淀。
(5)在小离心机上10000 rpm离心10 min,吸净上清液。加入1 ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中,待用。
2.  Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA,提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化,试剂包括:50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
(1)吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
(2)加100 ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
(3)加1 ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
(4)取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
(5)将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2 ml 80%异丙醇,对微型柱进行清洗。
(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12 000 g离心20秒,以除去微型柱中的洗液。
(7)将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50 μl TE或水,静止1分钟后,12 000 g离心20秒。
(8)丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1.  将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2.  在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3.  加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4.  按前面三中所述,用酚:lv仿:抽提二次。
5.  加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1 h。
6、离心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1.  在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2.  加1 ml T4DNA连接酶,1 ml 10×连接缓中液,混匀,16℃连接过夜。
3.  取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1.  在50 ml的PCR产物中,直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2.  37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
3.  用酚:lv仿抽提2次。
4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7 ml ddH2O中。
5.  质粒用Smal 切开后,70℃ 15分钟灭活酶,取1 ml (约0.1 mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ,连接缓冲液1 ml 。
6.  取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

注意事项:

1.  PCR反应液可直接用于连接,但最好对PCR产物纯化后进行连接,既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。
2.  PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3.  吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
4.  加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5.  应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6.  纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7.  PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会影响提取DNA的 产量。

 

 

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