渗透压对谷氨酸棒杆菌葡萄糖转运和高产谷氨酸的影响

摘要:谷氨酸棒杆菌对葡萄糖的摄取主要通过对葡萄糖具有高亲和力(Km=0.35 mM)的甘露糖磷酸转移酶系统(PTS)。选择能够耐受2-脱氧葡萄糖(2DG)和缺乏PEP依赖的葡萄糖转运活性的突变体,这些突变体能够在以葡萄糖为单一碳源和能源的培养基上生长,由于采用的是低亲和力(Ks=11 mM)的非PTS摄取系统,所以摄糖速率显著降低。在不同渗透压的培养基中生长,野生型细胞比葡萄糖消耗速率和比生长速率降低。当这些培养物的细胞在标准条件下测量时显示具有相似的PTS活性。然而,当细胞重新悬浮在不同渗透压的缓冲液中时,PTS活性显示与渗透压相关。这种抑制效应能够解释在高渗透压发酵培养基中观察到的糖吸收和生长速率下降的原因。但是非PTS葡萄糖转运系统不受培养基渗透压的影响。在工业生产条件下随着谷氨酸积累培养基渗透压相应增加,观察到对糖转运能力的类似抑制。这种现象从而限制了发酵过程,因为比速率的降低会导致细胞维持而消耗的糖比例增加,同时伴随着产品产率的降低。

关键词:葡萄糖转运;渗透压;谷氨酸发酵;谷氨酸棒杆菌;

研究内容:

1、渗透压对PTS葡萄糖摄取系统活力的影响

渗透压800mOsmol/Kg以内PTS活性维持恒定,之后随着渗透压升高PTS活性线性下降。渗透压1900mOsmol/Kg时PTS活性只有最高时的15%。

2、渗透压对谷氨酸发酵的影响

谷氨酸和次级代谢产物的积累会引起培养基渗透压的显著增加,为了维持pH值恒定,碱(在本例中为氨)的加入进一步加剧了渗透压的增加。在谷氨酸棒状杆菌温度敏感菌株2262中观察到这一现象,该菌株能够达到高产物浓度(谷氨酸>85g/L)并且渗透压超过2000mOsmol·kg-1。在最初几个小时内糖的消耗率保持不变,然后逐

渐下降。为了检验活性减弱是否与谷氨酸累积导致的渗透压增加相关,测量了PTS活性对总糖摄取量的贡献,在野生菌谷氨酸棒状杆菌ATCC17965中测量的贡献一致,即4.5 mmol.g-1·h-1。在谷氨酸生产菌株中,总糖摄取更快,表明渗透酶活性更高。在非胁迫条件下测得的葡萄糖摄取速率表明在谷氨酸棒状杆菌2262中渗透酶贡献高达25%的总葡萄糖摄取量。按照PTS转运系统的体外测量方法测定渗透应激对PTS活性的抑制影响,在葡萄糖补料条件下(渗透酶的贡献可以忽略不计)(低残留葡萄糖,即小于2g·l-1),可以看到葡萄糖消耗量的下降与预测的PTS活性下降非常接近(图3a)。当采用维持较高浓度的葡萄糖补料策略(50 g·l-1),葡萄糖消耗有改善可能是由于渗透酶活性和反应器中存在的葡萄糖对该系统的饱和度高(图3b)。在这种条件下,高葡萄糖消耗率导致额外代谢物的较早出现,如乳酸。

3、对谷氨酸产率的影响

一旦培养基中的渗透压增加,代谢活性下降的后果之一是发酵结束时谷氨酸产量显著降低。葡萄糖消耗率的下降会引起谷氨酸产率的下降,这是由于转化为CO2的葡萄糖比例增加。在整个生产阶段CO2产量大致保持恒定,这表明从糖分解代谢中获得生化能量来满足细胞维持的需求恒定,这种需求与发酵罐内的生物量成比例,

因此糖比消耗速率的降低需要增加所用糖的比例。当使用谷氨酸棒状杆菌的维持系数0.6mmol葡萄糖/g细胞/h计算,用于细胞维持需要的葡萄糖的比例从谷氨酸生产的初始阶段总糖消耗的15%增加到发酵后期渗透压最高时的40%(图4)。在发酵后期观察到的谷氨酸产率下降与维持需求的碳代谢流的变化一致。根据代谢活性减弱期间代谢需氧量降低,则根据氧变化控制残糖浓度可能恢复部分产率损失。

4.讨论

本文说明了谷氨酸发酵后期的抑制与产物积累和渗透环境对糖吸收能力的控制影响直接相关。这种现象不是由于基因表达水平的变化,而是由于渗透胁迫条件下转运系统的生化活性发生了改变。此外,这种效应是可逆的,因为一旦渗透胁迫被消除,被洗涤的细胞仍能恢复其转运糖的能力。同样,当重悬于高渗的缓冲液中时,正常生长的细胞糖转运能力也显著降低。随着渗透压的增加,这种生理效应会导致耗糖能力下降和代谢速率减慢。由于维持生物量的能量要求保持不变,而且在许多情况下会需要增加额外能量以满足对抗此类压力,这也将导致产品产率下降。越来越多的糖消耗将用于能源生产,因此会以减少产品为代价,以二氧化碳的形式损失掉。对于谷氨酸发酵,随着培养基渗透压的增加,产量和产率均显著降低。引发PTS蛋白转运能力下降的生化机制仍有待确定,但可能与蛋白/膜复合体的结构变化相关。更高效或更快速地生产谷氨酸的菌株达到渗透阈值将更快,这将导致发酵24小时后可能产量不会提高。因此,筛选具有高耐压能力的菌株对发酵是有益的,从而确保工业菌株足够健壮,在获得高产物产量时能维持高代谢活性。另一条克服这种代谢抑制的路径则是开发一种发酵系统,能够整合下游提取过程在发酵积累时去除产物。