副溶血性弧菌

副溶血性弧菌复苏步骤注意事项：

【材料】
1.  常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。
2.  培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）
【操作程序】
1.  细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
2.  培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min,备用。
3.  二甲基亚砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min,备用。
4.  从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400C水浴中,快速摇晃,直至冻存液*融化。
5.  将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心（1000r/min,5min）。
6.  用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。
7.  记录复苏日期。
副溶血性弧菌常见问题及解决方案：
细胞漂浮：培养瓶不开封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。次日观察,如细胞大部分又贴回瓶底,表明细胞活力正常,剩余漂浮的细胞可以离心去掉,留10ml培养液培养观察,细胞生长至汇合度80%,进行消化传代；如细胞还是不贴壁,将细胞离心收集转到新培养瓶,原培养瓶加部分培养液继续培养,中间注意观察,我们的技术人员会一直跟踪技术指导,直到问题解决。

客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项,确保细胞的培养条件*,如果由于培养条件不*导致细胞出现问题,责任由客户自行承担。由于运输的情况,所以个别细胞会出现不稳定,客户收到细胞后务必*时间和我们,告知细胞具体情况,以便我们技术人员能及时有效的和老师沟通,不胜感谢！

【注意事项】
1.  取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。
2.  冻存液的问题：冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是*无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大,因此,必须在1-2min内使冻存液*融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜（DMSO）选择进口产品。
3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。
4.  离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大, 死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO）,DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液 体前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。
5.  细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6.  复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。
7.  加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞zui易受损的－5～0℃,细胞仍能生长,活力受损不大
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。
二、操作步骤
（一）冻存
1、消化细胞（同实验二）,将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟,弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。
三、
试剂和器材
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等
试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。