Pierce™ 直接 IP 试剂盒

Thermo Scientific Pierce 直接 IP 试剂盒使用活化树脂以共价方式将 IP 抗体（任何物种或类别）固定至琼脂糖微珠,无需使用蛋白 A/G,从而在无抗体干扰的情况下实现免疫沉淀。

该方法的主要优势是有机会使用任何物种或亚类的纯化抗体（而不仅仅是与蛋白 A 或 G 结合的类型）和能够在不受抗体污染的情况下纯化靶蛋白。使用该方法,还可从血清样品中免疫沉淀抗原,而不会共纯化非靶向免疫球蛋白。最后,该试剂盒使用微量离心杯从微珠状琼脂糖树脂中有效清洗和分离样品。

直接 IP 试剂盒的特点：

• 仅需少于 10 µg 抗体— 经优化的程序进行单一 IP 实验时仅需 2 至 10 µg 抗体,不多于传统 IP 方法需要的抗体量
• 简单高效的可扩展性— 仅使用单一免疫沉淀实验所需的抗体量或固定 100 至 200 µg 抗体即可制备即用型 IP 亲和树脂用于许多实验
• 极低抗体污染— 将抗体不可逆地连接至琼脂糖微珠,从而尽可能减少重链和轻链与纯化蛋白共洗脱（即,低于 5%）
• 使用任何物种和亚类的抗体进行 IP— 使用鸡 IgY、人 IgE、小鼠 IgM 或任何其他纯化蛋白
• 制备的抗体亲和树脂可重复使用— 抗体以共价方式固定化,且不会被温和洗脱程序灭活,因此树脂通常可重复使用数次
• 便利的样品处理— 离心柱（参见尺寸）可消除树脂损耗并可高效分离溶液
• 全套试剂盒— 包装包括细胞裂解缓冲液和足以进行至少 50 次抗体固定和 IP 实验的试剂和离心柱
• 需要纯化抗体— IP 抗体溶液必须不含 BSA、明胶或其他稳定剂蛋白；如需轻松去除这些蛋白,请参见我们的抗体纯化试剂盒（产品编号 44600）

应用：
•随后通过电泳和蛋白切除进行质谱或测序鉴定分析的免疫沉淀；
•对分子量与重链或轻链抗体片段相似的靶蛋白进行的免疫沉淀和 SDS-PAGE 分析
•对通过非变性方法（即,不涉及 SDS-PAGE 的方法）进行后续分析的靶蛋白进行的免疫沉淀
•使用未结合至蛋白 A、蛋白 G 或蛋白 A/G 进行的免疫沉淀
•从血清或含免疫球蛋白的其他样品中进行的免疫沉淀

通过两个简单步骤进行直接免疫沉淀：

步骤 1：将抗体连接至琼脂糖树脂：直接 IP 方法的步是制备 IP 抗体亲和树脂。在含适当体积 AminoLink Plus 偶联树脂（醛活化微珠状琼脂糖树脂）的磷酸盐缓冲液中孵育纯抗体（参见产品优势）。在孵育过程中,大抗体分子表面上的各种赖氨酸 ε 胺与树脂上的醛基团发生反应,从而形成席夫碱键,然后在存在氰基氢化物的情况下稳定为仲胺键。固定化反应（被称为还原胺化）是一种非变性反应,产生的抗体偶联效率通常高于 85%,且抗原结合功能损失极小。

步骤 2：进行免疫沉淀实验：制备后,抗体树脂可以多份平行等份试液或整体形式进行 IP 实验。将抗体树脂与含有目标蛋白抗原的样品一起孵育,可使抗体:抗原复合物形成。进行洗涤以去除样品中的非结合（可能不需要）组分后,通过使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液从抗体中解离来回收抗原。在微量离心杯中完成整个程序,使得短暂离心后溶液与琼脂糖树脂分离。只有通过该程序对抗原进行洗脱,才能在不受抗体片段干扰的情况下识别和进一步分析抗原。此外,抗体树脂可以重复使用,用于其他轮次的免疫沉淀。

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